CROMATOGRAFIA


Cromatografia grupează o variată şi importantă grupă de metode care permit cercetătorului să separe compuşi foarte asemănători din amestecuri complexe. În toate separările cromatografice proba este dizolvată într-o fază mobilă: gaz, lichid sau fluid supercritic. Această fază este frecvent numită eluent, iar după ce trece de capătul coloanei se numeşte eluat.

Metoda cromatografică a fost descoperită de botanistul rus Mihail Tsvet, în 1906 şi a fost folosită întâi pentru separarea unor substanţe colorate pe coloană sau ca eluate colorate. Dacă substanţele sunt incolore, prezenţa lor pe coloană sau în eluate se recunoaşte prin alte metode.

Metodele cromatografice sunt bazate pe adsorbţia amestecului de substanţe (solid-lichid;lichid-lichid; gaz-lichid) pe un material adsorbant, urmată de desorbţia succesivă (cu ajutorul unui dizolvant adecvat – eluant) a componentelor din amestec.

Coloana de adsorbant poate fi înlocuită, în unele variante cu o foaie de hârtie poroasă preparată în mod special (cromatografie pe hârtie) sau cu un strat subţire de adsorbant fixat pe o placă de sticlă, cu ajutorul unui liant (cromatografie în strat subţire).

Separarea compusului de analizat de potenţialele interferenţe este unul din paşii esenţiali în analiza chimică. Cromatografia este una dintre cele mai frecvent utilizate metode pentru a realiza aceste separări analitice. Aplicaţiile cromatografiei cresc exponenţial cu timpul, în mare parte datorită faptului că ea îşi găseşte aplicaţii în toate ramurile ştiinţei. Este rapidă, simplă, cu costuri relativ reduse şi variabilitate mare relativ la alegerea metodei de separare.

O analiză cromatografică se rezumă în general la următoarele concepte fundamentale:

• proba este dizolvată în faza mobilă;

• faza staţionară este cel mai frecvent un lichid adsorbit la suprafaţa unor particule de solid utilizate pentru a împacheta coloana;

• faza mobilă este trecută peste faza staţionară nemiscibilă; aceasta se numeşte eluţie;

• solutul care are o mare afinitate faţă de faza mobilă se va mişca prin coloană foarte încet;

• componenţii probei se vor separa în benzi discrete vizibile la detector, şi rezultă cromatograma.

Cromatografia a devenit principalul instrument pentru separarea speciilor asemănătoare. Ea poate fi de asemenea utilizată pentru determinări cantitative şi calitative ale speciilor separate,

În termeni de informaţie calitativă, o cromatogramă furnizează timpul de retenţie al speciilor sau poziţiile acestora pe faza staţionară după un timp de eluţie specific. Cromatografia poate fi extrem de utilă pentru recunoaşterea prezenţei sau absenţei unor componenţi în amestec ce conţine un număr limitat de specii cunoscute. Confirmarea identităţii serveşte şi pentru alte investigaţii, şi nu în ultimul rând cromatografia serveşte ca precursor pentru alte analize chimice calitative sau pentru analize spectroscopice.

Informaţia cantitativă este principalul motiv pentru care cromatografia are o atât de largă folosinţă. Ea se bazează pe compararea mai multor înălţimi sau suprafeţe ale picurilor analitice cu etaloane. Analiza bazată pe aria picurilor, care este independentă de efectele de deformare este mult mai precisă şi de aceea mult mai comună. Oricum, toate datele cantitative sunt dependente de prepararea standardelor şi calibrările succesive ale coloanei folosind aceste standarde. Fără exactitate şi calibrare precisă a datelor, nici o dată cromatografică nu poate fi considerată exactă.

Sunt 5 categorii de cromatografii: de adsorbţie; de partiţie; cu schimb de ioni; prin excluziune moleculară; de afinitate.

Metodele de cromatografie pot fi de asemenea clasificate în două moduri: cromatografia planară şi cromatografia pe coloană. Ele sunt bazate pe interacţiunea fizică, ceea ce înseamnă că faza staţionară şi faza mobilă sunt în contact. În cromatografia pe coloană, faza staţionară este introdusă în interiorul unui tub îngust şi faza mobilă este introdusă în tub cu ajutorul presiunii sau a greutăţii proprii. În contrast, cromatografia plană foloseşte o fază staţionară care este depusă pe o suprafaţă plană sau în hârtie. Faza mobilă se deplasează prin faza staţionară datorită acţiunii
capilare sau a greutăţii.

Cromatografia de lichide, gaze şi de fluide supercritice sunt 3 clase generale bazate atât pe tipurile de faze mobile şi staţionare cât şi tipurile de echilibre implicate în transferul solutului între faze. Fazele mobile sunt gaze, lichide şi fluide supercritice. Fazele staţionare variază şi tipul de echilibru este dependent de alegerea acestei faze.

Cromatografia de adsorbţie utilizează o fază staţionară solidă şi o fază mobilă care este un lichid sau un gaz. Solutul poate fi adsorbit la suprafaţa particulelor solide, unde echilibrul dintre starea adsorbită şi soluţie produce separarea moleculelor solutului.

În cromatografia de partiţie faza staţionară este un film subţire pe suprafaţa unui suport solid. Solutul stabileşte un echilibru între lichidul staţionar şi faza mobilă (lichidă sau gazoasă).

În cromatografia de schimb ionic anionii sau cationii sunt legaţi covalent de o fază staţionară solidă, frecvent o răşină sau o fază solidă tare şi amorfă. O fază mobilă lichidă este utilizată. Ionii solutului de sarcină opusă sunt atraşi de faza staţionară datorită forţelor electrostatice.

Cromatografia de excluziune moleculară este mai comun denumită de gel permeabil sau de filtrare cu gel. Această tehnică separă moleculele după mărime şi moleculele mari trec cu o viteză mai mare decât moleculele mici. Nu există interacţiuni atractive. În loc, faza mobilă gazoasă sau lichidă este trecută printr-un gel poros, care exclude moleculele mari, dar nu şi pe cele mici.
Moleculele mari curg peste fără a intra în gel, şi ele eluează primele.

Cromatografia de afinitate este bazată pe interacţiunea între un tip de molecule de solut şi un al doilea tip, acestea legate covalent de faza staţionară. Când un amestec este trecut prin coloană, doar un tip de molecule de solut reacţionează cu moleculele legate şi formează legături la răşină.

Moleculele de solut dorite sunt dislocate apoi de moleculele legate variind pH-ul sau tăria ionică a solventului .

În cromatografia de gaze (GC) lichidul volatil este injectat cu ajutorul unei pompe de cauciuc într-un port injector, care vaporizează proba. Probele gazoase pot fi injectate folosind osiringă adecvată. Un gaz inert purtător poartă proba prin coloana ce conţine faza staţionară.

Gazul purtător serveşte ca fază mobilă. După traversarea coloanei, particulele separate de solut intră într-un detector. Răspunsul este afişat pe un calculator ca funcţie de timp.

În cromatografia pe strat subţire (TLC), un spot de probă este aplicat peste o bucată de hârtie sau sticlă având faza staţionară impregnată. Capătul suprafeţei de hârtie sau sticlă este apoi scufundată într-o cantitate de solvent, care serveşte ca fază mobilă. Solventul migrează de-a lungul fazei staţionare, separând componenţii probei în lungul drumului său.

Când solventul ajunge în vecinătatea părţii superioare, este înlăturată cantitatea suplimentară

de solvent şi este lăsat să se usuce. Câţiva dintre componenţii probei sunt vizibili în acest moment.Alte măsurători sunt în mod curent efectuate pentru a detecta toţi componenţii probei .

Cromatografia de lichide de înaltă performanţă (HPLC) referă noile proceduri de

cromatografie de lichide bazate pe o instrumentaţie sofisticată.

Acestea sunt cele mai mult folosite dintre toate metodele de separare .

Detecţie

Foarte multe detectoare sunt angajate în separările cromatografice. Detecţia absorbanţei moleculare UV-VIS este cea mai comună. Detectorul ideal este necesar să aibă: sensibilitate adecvată; bună stabilitate şi reproductibilitate; timp de răspuns scurt; răspuns liniar la diferite ordine de concentraţie; stabilitate pe un larg domeniu de temperatură; durată lungă de viaţă şi uşurinţă în utilizare.

Monocromatorul este adesea o componentă a instrumentului UV-VIS. El permite scanări

spectrale, ceea ce înseamnă capacitatea de a varia lungimea de undă a radiaţiei în mod continuu într-un domeniu larg. Fantele monocromatorului joacă un rol important. Fanta de intrare serveşte ca sursă de radiaţie. Fantele largi sunt tipic utilizate pentru determinări cantitative în care detaliulspectral este important, în comparaţie cu analiza calitativă.

Metode de prelucrare a informaţiei cromatografice

Metoda standardului intern furnizează cea mai mare precizie pentru cromatografia cantitativă deoarece ea elimină incertitudinile introduse de simpla injecţie. În această metodă, o cantitate exact măsurată de substanţă este adăugată fiecărui standard sau probe. Standardul intern trebuie să fie ales astfel încât el să se separe foarte bine de celelalte picuri componente ale probei.

De asemenea, picul standard trebuie să fie aproape de picul analitic. Cantitatea de substanţă din picul de standard intern serveşte apoi ca parametru analitic.

Metoda normalizării ariilor este o altă aproximare utilizată pentru eliminarea incertitudinilor asociate cu simpla injecţie. În această metodă, aria tuturor picurilor complet eluate este calculată. Concentraţia analitică este găsită ca raport al ariei de pic la aria totală a tuturor picurilor.

Lărgimea benzii în cromatografie

O cromatogramă:

• ilustrează răspunsul detectorului la un compus de analizat din probă la ieşirea acestuia din coloană ca funcţie de timp sau de volum de fază mobilă adăugată;

• este utilă atât pentru determinările cantitative cât şi calitative;

• furnizează o serie de picuri, unde aria de sub picuri furnizează informaţia cantitativă despre cantitatea de component iar poziţia picului serveşte pentru identificarea compusului din probă;

Câteva forme de bandă pe cromatogramă este posibil să depindă de concentraţia compusului de analizat în fazele mobilă şi staţionară şi de comportamentul fiecărui compus în parte .